Основна маса АТФ утворюється на мембранах мітохондрій в ході окисного фосфорилювання H-залежної АТФ-синтазою. Субстратне фосфорилювання АДФ не потребує участі мембранних ферментів, воно відбувається у цитоплазмі в процесі гліколізу або шляхом перенесення фосфатної групи з інших макроергічних сполук.

Для синтезу 1 молекули АТФ необхідно перенести всередину мітохондрій 3 іона Н+ за градієнтом концентрації, тому за рахунок окислення 1 молекули НАДН можна синтезувати 3 молекули АТФ, а з допомогою окислення 1 молекули ФАДН2 – 2 молекули АТФ.

Місцем синтезу АТФ у клітинах рослин є мітохондрії, в яких відбувається клітинне дихання, та хлоропласти, в яких АТФ утворюється у світловій фазі ( ). В апараті Гольджі сортуються білки, а синтезуються там деякі вуглеводи (олігосахариди), але не АТФ ( ).